研究前沿 | 银耳对皮肤增白和创面愈合的体外作用

黑色素是一组存在于大多数生物体内的色素，由表皮黑色素细胞产生。黑色素的形成是一个多阶段的化学过程，包括酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白，以及酪氨酸的氧化和聚合。酪氨酸酶是黑色素形成中的限速酶，催化黑色素生成的两个关键步骤。大量研究报道抑制黑色素生成可以防止皮肤晒黑和色素沉着。此外，皮肤损伤的处理一直是整形外科医生和皮肤科医生面临的挑战。皮肤损伤可诱导炎症反应。黑素细胞及其在黑素发生过程中的生成受到重要细胞介质的多种影响。皮肤病变炎症的增加导致黑素生成的增加和延长，这可能导致黑素细胞增殖和黑素瘤不受控制。此外，正常黑素生成被破坏的皮肤损伤会导致色素沉着障碍。因此，大量的研究致力于促进伤口的快速愈合和减少受伤皮肤的炎症，以防止由此产生的结痂组织的色素沉着异常。开发能够实现色素沉着病灶的恢复和漂白的制剂是化妆品行业面临的主要挑战。

  真菌银耳(Tremella fuciformis，TF)(图1A)，俗称白木耳、雪耳等，广泛分布，特别是在热带地区，主要生长在阔叶树的枯枝上。银耳被商业化种植，并广泛用于烹饪和草药。银耳通常干燥保存(图1B)，或加工成粉末用药(图1C)。银耳富含蛋白质、多糖和膳食纤维，但能量和脂肪含量较低。银耳具有多种生物活性，包括免疫调节、抗氧化、抗高血糖、抗高胆固醇血症、抗肿瘤和帮助治疗记忆障碍。然而，迄今为止，还没有关于银耳对皮肤亮白和体外伤口愈合的影响的研究报道。本研究的目的是研究银耳对小鼠B16F10黑色素瘤细胞系、人HaCaT角化细胞和Detroit 551成纤维细胞的体外作用。

图1. （A）鲜银耳子实体，（B）银耳干品，（C）银耳粉末

研究方法：

  体外研究银耳对小鼠B16F10黑色素瘤细胞黑色素生成的影响：将细胞暴露在不同浓度的银耳(50、100、200和300 μg/ml)中测定形态学和细胞活力；将细胞暴露在不同浓度的银耳(50、100、200和300 μg/ml)中48 h，然后在存在或不存在0.5 μM α-黑素细胞刺激(α-MSH)的情况下再孵育24 h，分别测定细胞的黑色素含量，免疫印迹法检测酪氨酸酶蛋白水平。

  动态伤口愈合试验：将HaCaT细胞(1×104 cells/well)划伤至96孔板过夜，然后在无血清DMEM中添加或不添加100和200 μg/ml 银耳处理。记录12小时内的细胞迁移图像和伤口宽度。

细胞迁移试验：将Detroit 551细胞转移到6孔组织培养板上培养24 h，细胞生长至90%合流。随后，每孔都用微移液管尖划破，形成恒定宽度(1毫米)的裸露区域。然后将细胞培养在无血清的MEM中，在37°C与不同浓度的银耳(100和200 μg/ml)孵育24小时。如前所述，在相位对比显微镜(×100)下对细胞和剥离区进行拍照。

结果：

  银耳浓度达到300 μg/ml时，小鼠黑色素瘤B16F10细胞的体外增殖不受影响。用不同浓度的银耳(50、100、200和300 μg/ml)处理细胞，并采用MTT细胞活力测定法进行分析。银耳处理没有引起细胞形态的变化(图2)，与未处理的细胞相比，B16F10存活细胞的数量没有显著影响。因此，在最高测试浓度300 μg/ml的银耳处理下，适合后续对黑色素合成和酪氨酸酶活性的评价。

图2. 不同浓度(50、100、200、300 μg/ml)银耳对B16F10小鼠黑色素瘤细胞形态的影响，细胞图像通过×200倍率的相位对比显微镜获得。

  银耳降低了B16F10细胞中的黑色素含量和酪氨酸酶水平。黑色素的产生是一个多阶段的化学过程，涉及酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白。测量了B16F10细胞的黑色素含量(图3)，在银耳处理后，黑色素含量呈现浓度依赖性下降趋势。与α-msh处理组相比，100、200和300 μg/ml银耳处理组的黑色素含量显著降低。酪氨酸酶是黑素形成的速率限制酶，催化两个关键步骤。因此，进一步评估了100、200和300 μg/ml 银耳处理后B16F10细胞中酪氨酸酶的水平，结果显示酪氨酸酶的表达呈浓度依赖性下降(图4)。

图3. 不同浓度银耳对小鼠B16F10黑色素瘤细胞黑色素含量的影响。分别在50、100、200、300 μg/ml的银耳溶液中浸泡48 h，然后加入或不加入0.5 μM α-黑素细胞刺激(α-MSH)孵育24 h。显示的结果是三次重复实验的平均值±标准偏差与α-MSH未治疗对照组相比，#p<0.05与α-MSH处理的对照组相比，***p<0.001。

图4. 不同浓度银耳对小鼠B16F10黑色素瘤细胞酪氨酸酶表达的影响。在100、200、300 μg/ml的银耳溶液中孵育48 h后，加入或不加入0.5 μM α-MSH孵育24 h。蛋白印迹法检测酪氨酸酶蛋白水平。β-肌动蛋白是为了保证负载均衡。

  银耳促进了人角质形成细胞(HaCaT)和皮肤成纤维细胞(Detroit 551)的细胞活力。此前有研究报道，伤口快速愈合可防止色素沉着和色素沉着异常。因此，用不同浓度的银耳(100和200 μg/ml)处理人角质形成细胞HaCaT细胞和人成纤维细胞Detroit 551细胞，用伤口愈合试验评估细胞迁移。HaCaT和Detroit 551细胞的结果显示，银耳处理组的边缘距离明显短于对照组。此外，通过Incucyte S3活细胞分析系统的动态观察也显示，在HaCaT细胞中加入或不加入银耳(100和200 μg/ml)后，伤口逐渐闭合。因此，银耳均以浓度依赖性的方式促进HaCaT和Detroit 551细胞迁移。

图5. 不同浓度的银耳（100和200μg/ml）对皮肤成纤维细胞（Detroit551）中细胞迁移的影响。拍摄细胞（A），并量化细胞迁移（B）。显示的结果是三次重复实验的平均值±标准偏差，与对照组相比，*p<0.05和***p<0.001。

讨论：

图6.银耳对皮肤增白和创面愈合的体外作用。

  自然皮肤增白已经被探索了几个世纪，因为它与年轻和美丽的文化联系在一起。含汞的皮肤增白剂曾被广泛使用；然而，随着它们与健康危害的联系，其受欢迎程度逐步下降。银耳作为潜在的皮肤增白剂受到了关注，这是关于银耳对肤色影响的研究。

  本研究报道了银耳对黑色素生成和促进伤口愈合的作用(图6)。银耳显著降低B16F10细胞中的黑色素生成和酪氨酸酶蛋白水平；能有效促进人角质形成细胞和成纤维细胞的迁移，并促进了人类HaCaT角质形成细胞和Detroit 551成纤维细胞的伤口愈合。数据表明，银耳可能在未来被证明是一种新型的皮肤增白候选者。在不久的将来，需要进一步的临床研究来评估银耳的有效性。

原文发表于：In Vivo 36: 713-722 (2022) Doi:10.21873/invivo.12757